LABTips: предотвращение ошибочной идентификации клеточной линии

Неправильная идентификация клеточной линии — одновременно разрушительная и пугающе распространенная проблема в исследованиях в области наук о жизни. В одном отчете о масштабах проблемы было указано 32 755 научных статей, в которых сообщалось об исследованиях с использованием ошибочно идентифицированных клеток, которые были дополнительно процитированы примерно в 500 000+ статей. По некоторым данным, от одной пятой до одной трети всех клеточных линий могут быть неправильно идентифицированы или контаминированы. Потенциальные последствия этой проблемы, включая неудачные эксперименты и отозванные статьи, что приравнивается к значительным потерям времени, средств и репутации, должны мотивировать все лаборатории и исследователей принять все меры для предотвращения и обнаружения ошибочной идентификации клеточных линий. Вот несколько советов, которые помогут исследователям-биологам сохранять бдительность и обеспечить целостность своих экспериментов с клеточными культурами:

Приобретая или получая новую клеточную линию, вы должны быть уверены, что клетки, поступающие в вашу лабораторию, правильно идентифицированы. Прежде чем выбрать какую-либо клеточную линию для работы, исследователи должны ознакомиться с Реестром ошибочно идентифицированных клеточных линий , который ведется Международным комитетом по аутентификации клеточных линий (ICLAC). Cellosaurus — еще один полезный ресурс для выбора подходящих клеток и исследования «проблемных» клеточных линий при планировании экспериментов.

Любые новые клетки всегда следует приобретать из надежного источника, например, из установленного репозитория клеток или непосредственно из лаборатории, где была создана клеточная линия. Это лучший способ убедиться, что клетки аутентифицированы и соответствуют исходному донору. Авторитетные источники должны предоставить документацию по аутентификации клеточной линии, которую принимающая лаборатория должна сохранить для своих записей, чтобы обеспечить отслеживаемость. Клетки, полученные из вторичных источников, таких как лаборатория, отличная от той, которая создала клеточную линию, с большей вероятностью будут неправильно идентифицированы или загрязнены, чем клетки из первичного источника или авторитетного хранилища клеток.

Даже при получении клеток из авторитетного источника рекомендуется провести собственное тестирование аутентификации до создания банка клеток или начала нового исследовательского проекта. Аутентификационное тестирование также следует проводить после проведения экспериментов, до представления каких-либо результатов для публикации, чтобы исключить любое загрязнение, которое могло произойти в период проведения экспериментов. Методы, основанные на генотипе, гораздо более надежны для аутентификации клеточных линий, чем методы, основанные на фенотипе, хотя изменения фенотипа, такие как изменения скорости роста или различия в морфологии, рассматриваемые под микроскопом, могут быть индикаторами возможной контаминации или генетического дрейфа, которые следует исследованы с помощью генетического тестирования.

Генотипирование коротких тандемных повторов (STR) является золотым стандартом для проверки подлинности клеточных линий человека, и методы STR также были разработаны для некоторых других видов, таких как мыши, крысы и африканские зеленые мартышки. Этот метод включает амплификацию локусов STR с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и определение длин аллелей STR с помощью капиллярного электрофореза. Данные аллеля STR, полученные из клеток, можно сравнить с эталонными базами данных, чтобы подтвердить, соответствует ли тестируемая клеточная линия исходной клеточной линии или донорской ткани. Генотипирование STR обладает превосходной дискриминационной способностью и, таким образом, может обеспечить высокую уверенность в том, что ваша клеточная линия является подлинной, а также надежно обнаружить ошибочно идентифицированные клеточные линии. Если метод на основе STR недоступен для вашего вида клеточной линии, следует использовать альтернативный метод на основе генотипа, утвержденный для вида, например, метод, основанный на секвенировании ДНК со «штрих-кодом».

Клеточные культуры могут быть контаминированы микробами, такими как бактерии или грибы, или могут быть перекрестно контаминированы другими клеточными линиями. Хотя важно предотвратить оба типа загрязнения, перекрестное загрязнение между клеточными линиями может остаться незамеченным из-за сходства между клетками одного и того же вида или из сходных групп (например, клеток млекопитающих), что позволяет сохранить зараженную клеточную линию. Загрязнение можно предотвратить, следуя надлежащей практике обращения с клеточными культурами, включая частую и тщательную стерилизацию рабочих мест и материалов, а также изоляцию различных клеточных линий друг от друга.

Все поверхности и оборудование, которые будут использоваться при работе с клеточной культурой, должны быть тщательно очищены дезинфицирующим средством, таким как 70% этанол, включая перчатки, инкубаторы, микроскопы, флаконы с реагентами и т. д. Автоклавирование также можно использовать для обеззараживания таких предметов, как штативы для инкубаторов или автоклавируемые пипетки. Любые задачи или эксперименты, которые будут проводиться в боксе биобезопасности, следует планировать заранее, чтобы в бокс помещались только необходимые предметы. Беспорядок внутри шкафа может нарушить поток воздуха, а риск загрязнения уменьшается, если предметы расположены на расстоянии друг от друга и хорошо организованы, чтобы уменьшить ненужные движения рук внутри колпака. Бутылки следует закрывать крышками, когда они не используются, а материалы, которые нужно пипетировать, следует переливать в стерильный контейнер, а не пипетировать непосредственно из исходного раствора, что может привести к загрязнению всего запаса. 5Кроме того, важно дать вытяжке достаточно времени, чтобы установить поток чистого воздуха — подождите не менее 15 минут после ее включения, прежде чем начинать работу.

Чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между клеточными линиями, важно работать только с одной клеточной линией за раз. Разные клеточные линии не следует помещать в одно и то же рабочее пространство, а процедуры очистки следует повторять при переключении работы на другую клеточную линию. Кроме того, запасы среды и реагентов должны быть предназначены для конкретных клеточных линий, чтобы дополнительно обеспечить изоляцию разных клеточных линий друг от друга.

Надлежащее документирование и маркировка клеточных линий могут предотвратить многие проблемы, которые могут привести к неправильной идентификации, такие как неправильная маркировка контейнеров или пробелы в информации о происхождении клеток, фенотипе или аутентификации. Лаборатории должны вести четкие и доступные записи о происхождении каждой клеточной линии, включая информацию о донорах и заболеваниях, типе клеток, времени получения клеточной линии и месте ее приобретения. Кроме того, исследователи должны регулярно документировать информацию об обращении с клеточными линиями, проведенных тестах (включая тесты аутентификации), количестве пассажей и фенотипических наблюдениях, которые могут включать микроскопические изображения и данные о росте. Эта документация может помочь определить любые изменения, которые могут указывать на загрязнение, продемонстрировать, когда клеточная линия была в последний раз аутентифицирована, и помочь проследить всю цепочку обработки при возникновении проблем.

Все сосуды для клеток, такие как криопробирки, планшеты или колбы, должны быть точно и тщательно промаркированы, при этом необходимо следить за тем, чтобы этикетка была читаемой и надежно прикрепленной к контейнеру. Печатные этикетки часто предпочтительнее, поскольку они устраняют проблемы с читаемостью, которые могут возникнуть из-за рукописного ввода, менее подвержены смазыванию, а также более эффективны в производстве. Напечатанные этикетки также позволяют использовать штрих-коды для документирования обработки клеточных линий. Этикетки должны быть написаны или напечатаны с использованием стойких к растворителям чернил, а контейнеры, которые будут помещены в морозильную камеру или криогенное хранилище, должны быть снабжены этикетками, рассчитанными на низкие температуры, поскольку в этих условиях обычные клеи могут не сработать. Этикетка должна содержать достаточную информацию для идентификации клеточной линии или культуры, например, название клеточной линии, дату, номер партии, номер пассажа и т. д.

К сожалению, как только клеточная культура, партия культур или запас клеточной линии загрязнены или иным образом скомпрометированы, клетки должны быть утилизированы – попытки восстановить частично загрязненную клеточную культуру или запас редко имеют смысл, даже если некоторые из исходных клеточная линия присутствует, и не стоит рисковать, используя клеточную линию, на которой отсутствует метка или известно, что она подверглась перекрестному загрязнению. К счастью, лаборатории могут свести к минимуму воздействие клеток, которые были скомпрометированы из-за загрязнения, генетического дрейфа или по другим причинам, поддерживая многоуровневую систему банка клеток, которая сохраняет запас аутентичных клеток раннего пассажа.

Основной банк клеток должен быть создан всякий раз, когда приобретается новая клеточная линия, при этом клеточная линия сначала помещается в карантин до тех пор, пока ее нельзя будет проверить на микоплазму и подлинность. Как только клеточная линия будет аутентифицирована, ее можно культивировать и размножать для создания мастер-банка, который хранится и консервируется в криогенных условиях. Небольшую часть ячеек из этого главного банка можно разморозить и расширить для создания работающего банка, при этом перед этим расширением будет проведено дополнительное тестирование качества и проверки подлинности. Наконец, клетки из криоконсервированного рабочего банка можно разморозить и культивировать для исследовательских проектов после дополнительного контроля качества и проверки подлинности. Скомпрометированные ячейки могут быть пополнены из рабочего банка, а рабочий банк может быть пополнен из главного банка при необходимости. Рекомендуется хранить мастер-банк и рабочий банк отдельно на случай серьезного инцидента, такого как отключение электроэнергии, который скомпрометирует весь запас. Эта многоуровневая банковская система предоставляет несколько «резервных» вариантов.